辅助生殖行业背景

我国不孕不育率逐年攀升，根据《柳叶刀中国妇幼健康特邀 重大报告》预测数据，2023年我国不孕率18.2% ，预计2025年将接近20%。不孕不育率的快速上升意味着辅助生殖服务潜在需求人数 增长，从而驱动辅助生殖市场扩容。辅助生殖（ART）由三种手段组成：人工授精、配子移植技术、体外受精-胚胎移植（IVF-EF）。其中体外受精-胚胎移植即试管婴儿，是指将不孕夫妇的卵子和精子通过人工方式取出，在体外培育受精并完成早期胚胎发育后，再移植回母体子宫内实现妊娠。

图1.辅助生殖诊疗过程（来源：艾瑞咨询）

辅助生殖技术：从“盲选”到“优选”的生育革命

中国每年新增出生缺陷儿约90万例，其中单基因遗传病占比高达22.2%。随着基因检测技术的突破，PGT（胚胎植入前遗传学检测）技术为这些家庭提供了从源头阻断遗传病的新选择。迄今为止，全球已经有数万例家庭通过试管技术助孕，顺利圆梦→获得健康宝宝!诚然一个个试管宝贝的诞生也见证了辅助生殖技术从无到有，从有到优的过程；该技术的不断更新升级更帮助人们有效解决“生不出”难题，且致力于化解“生不好”的困扰。

PART.1

什么是第三代试管婴儿PGS和PGD技术?

第三代试管婴儿即胚胎植入前遗传学筛查诊断技术(PGS/PGD)，主要是对胚胎的遗传物质进行检测。PGS即胚胎植入前遗传学筛查，是对胚胎的染色体数目和结构进行检测，分析对比是否有重复、缺失或易位等异常情况；PGD即胚胎植入前遗传学诊断，是对染色体上的基因进行检测，诊断胚胎有没有携带导致某种特定疾病的基因突变。

根据世界卫生组织的定义，PGD\PGS有了新的命名，统一称PGT，包括PGT-A,PGT-M,PGT-SR；PGT技术通过在体外受精后对胚胎进行基因检测，筛选出无遗传缺陷的胚胎进行移植，将遗传病防控从产前诊断提前至胚胎阶段。这一技术被誉为“第三代试管婴儿”。

图2.PGT的工作流程

PART.2

PGT 的分类

表1.PGT的分类

PGT-A

利用单细胞扩增技术和NGS技术对辅助生殖过程中体外培养的卵裂期或囊胚期胚胎进行检测，既单细胞测序全基因组扩增（WGA），该技术可检测全部的23对染色体非整倍体、≥4Mb的染色体片段缺失和重复、≥10Mb且比例≥30%的嵌合和夫妇一方或双方已知1-4 Mb遗传型CNVs。测序数据量1-2 M左右。

目前存在的主要三种扩增方法有：简并寡核苷酸引物PCR扩增（DOP-PCR）、多重置换扩增（MDA）、多次退火环状循环扩增（MALBAC），三种方法各有优缺点。

表2.单细胞扩增技术的三种方法对比

DOP-PCR

采用随机引物或者部分随机引物，通过热循环实现指数扩增，具体来说DOC-PCR（Degenerate Oligonucleotide Primed PCR），即退化寡核苷酸引物PCR，是随机扩增得到全基因组序列的；这不同于一般的PCR，一般的PCR只能扩增特定的DNA片段。该技术需要使用简并配对引物，即类脱氧肌苷引物，它可以结合到DNA任何部位。引物的3’端为6bp退化寡核苷酸，5’端为正常的碱基。3’端和DNA链随机结合，最初几个循环退火温度要低（30℃左右），然后延伸直到5’端引物配对处。但该技术容易造成碱基对突变、短串联重复( short tandem repeat，STR)增加或减少。

图3.DOP-PCR原理

多次退火环状循环扩增技术

技术原理：拟线性的扩增过程降低了指数扩增的序列偏好性。扩增引物，5’含有27 bp的共同序列，3’是8 bp的随机序列。利用特殊的随机引物，使扩增产物能首尾互补形成环，进行近乎线性的全基因组预扩增，再通过PCR技术进行指数式扩增，从而降低扩增过程中错误累积。扩增偏好性可重复，适合CNV检测；聚合酶保真性一般，不适合SNV检测。

图4.MALBAC原理图

多重置换扩增

采用随机6碱基引物，在恒温条件下，由Phi29 DNA聚合酶引导，与模板DNA结合，进而置换模板的互补链，而后循环扩增。Phi29 DNA聚合酶相对传统的DNA聚合酶具备更高的扩增效率和保真性。具体来说MDA扩增原理是使用随机的六聚体引物和phi29DNA聚合酶进行反应，在恒温条件下进行扩增。该聚合酶具有很强的链置换特性，可扩增产生50~200 kb的DNA片段，可用于构建大片段文库，同时该酶还能以新合成的DNA子链为模板，继续合成新的DNA子链，扩增产量高，同时由于其3’-5’核酸外切酶活性和校对活性，phi29 DNA聚合酶具有很高的复制保真性，准确性更高、基因组覆盖度更高，适用于SNV分析。虽然产物产量高和扩增产物长度可达100 Kb左右，覆盖度好，但是对样本质量要求高且指数扩增的偏好性重复性不好，不适合CNV类检测。

图5.MDA单细胞基因组测序流程

PART.4

生育健康NGS检测产品选择指南